參考周期：常規(guī)試驗7-15工作日,，加急試驗5個工作日,。

注意：因業(yè)務(wù)調(diào)整,暫不接受個人委托測試,望諒解(高校、研究所等性質(zhì)的個人除外)。

細(xì)胞劃痕實驗步驟

　　1,、劃線：先用 marker 筆在 6 孔板背后,，用直尺比著，均勻的劃橫線,，大約每隔 0.5～1cm 一道,，橫穿過孔，每孔至少穿過 5 條線;

　　2,、鋪板：處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于 6 孔培養(yǎng)板;細(xì)胞鋪板 6w/孔,，接種原則為過夜后融合率達(dá)到 100%,，每孔最終的培養(yǎng)基總量 2mL;

　　3、細(xì)胞培養(yǎng) 37℃,、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h;

　　4,、劃痕：第二天用 200 微升槍頭比著 6 孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕,，槍頭要垂直,，不能傾斜;

　　5、清洗：PBS 沖洗細(xì)胞 3 次,，除去劃下的細(xì)胞,，加入無血清培養(yǎng)基;

　　6、拍照：擦去 6 孔板背后的 marker 橫線劃痕,。4 倍鏡下進(jìn)行拍照,，保證劃痕居中且垂直，注意背景一致,，加入待測樣本,，設(shè)置濃度梯度，可按 0,6,12,24h 時間點取樣,，拍照,。

　　7、結(jié)果分析,，使用 ImageJ 軟件打開圖片后,，隨機劃取 6 至 8 條水平線，計算細(xì)胞間距離的均值或者劃痕面積均值,。

　　8,、數(shù)據(jù)處理：

　　細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t 時刻劃痕面積)/初始劃痕面積細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細(xì)胞間距離均值-t 時刻細(xì)胞間距離均值)/初始細(xì)胞間距離均值

細(xì)胞劃痕實驗注意事項

　　1、劃線的目的只是為了輔助劃痕時劃的更直,，有利于后續(xù)拍照分析,，劃線會在拍照前擦去,。

　　2、細(xì)胞接種數(shù)量需根據(jù)細(xì)胞生長速度和狀態(tài)而定,，接種原則為過夜后融合率達(dá)到 100%,，即細(xì)胞間沒有空隙，否則會影響后續(xù)拍照分析,。

　　3,、同濃度不同孔之間劃痕最好使用同一只槍頭，減少劃痕距離的誤差,。劃痕時槍頭垂直,，不能傾斜，可比著直尺或孔板蓋,，保持力度一致,，一次性劃完。

　　4,、沖洗時要溫柔,，貼壁加入，避免沖掉單層細(xì)胞,，反復(fù)多次沖洗,，盡量洗掉所有的細(xì)胞碎片。

　　5,、降低細(xì)胞增殖對遷移造成的假陽性結(jié)果的方法：①使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對實驗結(jié)果的影響;②一般認(rèn)為 24h 為細(xì)胞的一個周期,，在選取合適的時間點(6,12,24h)檢測劃痕寬度時，最好不要超過細(xì)胞一個周期的時間;③如果要單純考慮細(xì)胞遷移,，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理 1h,，抑制細(xì)胞的分裂。

　　6,、盡量保證各個劃痕寬度一致,，人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實驗結(jié)果,，這也是該方法最大的缺陷,，有條件的同學(xué)可以選擇 culture Insert(如下圖)，將細(xì)胞接種于 Dish 中間的 Insert,，培養(yǎng),。細(xì)胞長滿 Insert 區(qū)域后用鑷子移除 Insert 即可產(chǎn)生 500um、1000um 寬度的劃痕,。

　　7,、不是所有的細(xì)胞都適合劃痕實驗,，一些細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長,，懸浮細(xì)胞更不能進(jìn)行劃痕實驗,。

　　工程師會根據(jù)不同產(chǎn)品類型的特點、不同行業(yè)和不同國家的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)以及客戶的需求,，選取相應(yīng)的檢測項目和方法進(jìn)行細(xì)胞劃痕實驗,。

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