參考周期：常規(guī)試驗(yàn)7-15工作日,，加急試驗(yàn)5個(gè)工作日。

注意：因業(yè)務(wù)調(diào)整,暫不接受個(gè)人委托測(cè)試,望諒解(高校,、研究所等性質(zhì)的個(gè)人除外),。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)步驟

　　1、劃線：先用 marker 筆在 6 孔板背后,，用直尺比著,，均勻的劃?rùn)M線，大約每隔 0.5～1cm 一道,，橫穿過孔,，每孔至少穿過 5 條線;

　　2、鋪板：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液,，接種于 6 孔培養(yǎng)板;細(xì)胞鋪板 6w/孔,，接種原則為過夜后融合率達(dá)到 100%，每孔最終的培養(yǎng)基總量 2mL;

　　3,、細(xì)胞培養(yǎng) 37℃,、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h;

　　4、劃痕：第二天用 200 微升槍頭比著 6 孔板蓋子或直尺,，平行或垂直于背后的橫線劃痕,，槍頭要垂直，不能傾斜;

　　5,、清洗：PBS 沖洗細(xì)胞 3 次,，除去劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基;

　　6,、拍照：擦去 6 孔板背后的 marker 橫線劃痕,。4 倍鏡下進(jìn)行拍照，保證劃痕居中且垂直,，注意背景一致,，加入待測(cè)樣本，設(shè)置濃度梯度,，可按 0,6,12,24h 時(shí)間點(diǎn)取樣,，拍照。

　　7,、結(jié)果分析,，使用 ImageJ 軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取 6 至 8 條水平線,，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值或者劃痕面積均值,。

　　8、數(shù)據(jù)處理：

　　細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t 時(shí)刻劃痕面積)/初始劃痕面積細(xì)胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細(xì)胞間距離均值-t 時(shí)刻細(xì)胞間距離均值)/初始細(xì)胞間距離均值

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

　　1,、劃線的目的只是為了輔助劃痕時(shí)劃的更直,，有利于后續(xù)拍照分析，劃線會(huì)在拍照前擦去,。

　　2,、細(xì)胞接種數(shù)量需根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和狀態(tài)而定，接種原則為過夜后融合率達(dá)到 100%,，即細(xì)胞間沒有空隙,，否則會(huì)影響后續(xù)拍照分析,。

　　3,、同濃度不同孔之間劃痕最好使用同一只槍頭，減少劃痕距離的誤差。劃痕時(shí)槍頭垂直,，不能傾斜,，可比著直尺或孔板蓋，保持力度一致,，一次性劃完,。

　　4、沖洗時(shí)要溫柔,，貼壁加入,，避免沖掉單層細(xì)胞，反復(fù)多次沖洗,，盡量洗掉所有的細(xì)胞碎片,。

　　5、降低細(xì)胞增殖對(duì)遷移造成的假陽(yáng)性結(jié)果的方法：①使用無(wú)血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響;②一般認(rèn)為 24h 為細(xì)胞的一個(gè)周期,，在選取合適的時(shí)間點(diǎn)(6,12,24h)檢測(cè)劃痕寬度時(shí),，最好不要超過細(xì)胞一個(gè)周期的時(shí)間;③如果要單純考慮細(xì)胞遷移，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理 1h,，抑制細(xì)胞的分裂,。

　　6、盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致,，人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性,，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷,，有條件的同學(xué)可以選擇 culture Insert(如下圖),，將細(xì)胞接種于 Dish 中間的 Insert，培養(yǎng),。細(xì)胞長(zhǎng)滿 Insert 區(qū)域后用鑷子移除 Insert 即可產(chǎn)生 500um,、1000um 寬度的劃痕。

　　7,、不是所有的細(xì)胞都適合劃痕實(shí)驗(yàn),，一些細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞更不能進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),。

　　工程師會(huì)根據(jù)不同產(chǎn)品類型的特點(diǎn),、不同行業(yè)和不同國(guó)家的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)以及客戶的需求，選取相應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目和方法進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),。

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